Różnica między RT PCR a QPCR

Kluczowa różnica - RT PCR vs QPCR
 

Reakcja łańcuchowa polimerazy jest techniką stosowaną do amplifikacji określonego regionu DNA in vitro. Dzięki wynalezieniu tej techniki przez Kary'ego Mullisa w 1983 r. Naukowcy są w stanie wykonać tysiące do milionów kopii określonych fragmentów DNA do celów badawczych. Obecnie stała się powszechną i rutynowo wykonywaną techniką w laboratoriach klinicznych i badawczych dla szerokiego zakresu zastosowań. Istnieją odmiany tradycyjnej techniki PCR, takie jak RT PCR, zagnieżdżona PCR, multipleksowa PCR, Q PCR, RT - QPCR itp. RT PCR i Q PCR to dwie ważne odmiany PCR. Kluczowa różnica między RT PCR i Q PCR jest taka RT PCR służy do wykrywania ekspresji genów poprzez utworzeniekomplementarne DNA (cDNA) transkrypty z RNA podczas Q PCR służy do ilościowego pomiaru produktów PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu barwników fluorescencyjnych.

ZAWARTOŚĆ
1. Przegląd i kluczowa różnica
2. Co to jest RT PCR
3. Co to jest QPCR
4. Porównanie obok siebie - RT PCR vs QPCR
5. Podsumowanie

Co to jest RT PCR?

Reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT PCR) jest odmianą PCR stosowaną do wykrywania ekspresji RNA. Jest to bardzo ważna metoda wykrywania ekspresji mRNA w tkankach. RT PCR stosuje się, gdy materiałem wyjściowym próbki jest RNA. W RT PCR matrycowy mRNA jest najpierw przekształcany w komplementarny DNA. Ten etap jest katalizowany przez enzym odwrotną transkryptazę, a proces ten znany jest jako odwrotna transkrypcja. Po drugie, tradycyjną PCR stosuje się do nowo zsyntetyzowanego cDNA do amplifikacji.

RT PCR jest bardzo czułą techniką, która wymaga stosunkowo niewielkiej ilości próbki RNA. RT PCR jest powszechnie stosowany w diagnostyce i analizie ilościowej gatunków RNA, zwłaszcza wirusów RNA, takich jak ludzki wirus niedoboru odporności i wirus zapalenia wątroby typu C..

Rycina 01: Technika RT PCR

Co to jest QPCR?

Ilościowa PCR (QPCR) jest odmianą PCR, która jest stosowana do ilościowego pomiaru produktów PCR. Jest również określany jako reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym, ponieważ mierzy amplifikację w czasie rzeczywistym za pomocą maszyny do PCR w czasie rzeczywistym. Jest to odpowiednia metoda określania ilości docelowej sekwencji lub genu obecnych w próbce. Interesującą cechą QPCR jest to, że łączy zarówno wzmocnienie, jak i prawdziwą kwantyfikację w jednym kroku. Dlatego potrzebę elektroforezy żelowej w wykrywaniu można wyeliminować techniką QPCR. QPCR wykorzystuje barwniki fluorescencyjne do znakowania produktów PCR podczas reakcji PCR, które ostatecznie prowadzą do bezpośredniej oceny ilościowej. Kiedy kumulują się produkty PCR, sygnały fluorescencyjne są również kumulowane i będą mierzone przez maszynę czasu rzeczywistego. QPCR można łączyć z RT PCR. Jest znany jako RT - QPCR lub QRT - PCR i jest uważany za najsilniejszą, czułą i ilościową metodę wykrywania poziomów RNA w komórkach lub tkankach.

SYBR Green i Taqman to dwie metody stosowane do wykrywania lub obserwowania procesu amplifikacji PCR w czasie rzeczywistym. Metodę SYBR Green przeprowadza się przy użyciu barwnika fluorescencyjnego o nazwie SYBR green i wykrywa amplifikację przez wiązanie barwnika w celu wytworzenia dwuniciowego DNA. Taqman jest przeprowadzany przy użyciu podwójnie znakowanych sond i wykrywa amplifikację poprzez degradację sondy przez polimerazę Taq i uwalnianie fluoroforu, jak pokazano na rycinie 02. Obie metody monitorują postęp procesu amplifikacji i raportują ilość produktu w czasie rzeczywistym.

PCR w czasie rzeczywistym ma wiele różnych zastosowań, takich jak kwantyfikacja ekspresji genów, analiza mikroRNA i niekodującego RNA, genotypowanie SNP, wykrywanie wariantów liczby kopii, wykrywanie rzadkich mutacji, wykrywanie organizmów zmodyfikowanych genetycznie, wykrywanie czynników zakaźnych itp..

Rycina 02: Ilościowa technika PCR

Jaka jest różnica między RT PCR a QPCR?

RT PCR vs QPCR
RT PCR to technika stosowana do wykrywania ekspresji genów przez amplifikację.	QPCR to technika, która wzmacnia DNA i ocenia ilościowo produkty PCR w czasie rzeczywistym.
Zaangażowanie enzymu odwrotnej transkryptazy
Enzymatyczną odwrotną transkryptazę stosuje się w RT PCR.	Enzymatyczna odwrotna transkryptaza nie jest stosowana w QPCR.
Zastosowanie cząsteczek znakowanych fluorescencyjnie
Barwione fluorescencyjnie barwniki lub sondy nie są używane do RT PCR.	Do QPCR stosuje się barwione fluorescencyjnie barwniki lub sondy.
Ocena ilościowa produktu PCR
Jeśli nie jest połączony z QPCR, RT PCR nie określa ilościowo produktu PCR.	QPCR mierzy ilościowo produkt PCR.
Materiał wyjściowy
Materiałem wyjściowym jest mRNA.	Materiałem wyjściowym jest DNA.
Synteza cDNA
Uzupełniające DNA jest wytwarzane podczas RT PCR.	Uzupełniające DNA nie jest wytwarzane podczas QPCR.

Podsumowanie - RT PCR vs QPCR

RT PCR i QPCR to dwie wersje tradycyjnej PCR. Technika RT PCR jest wykonywana dla próbek mRNA i jest sterowana przez odwrotną transkrypcję i produkcję cDNA. QPCR służy do ilościowego oznaczania produktów PCR podczas cykli termicznych PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu barwników fluorescencyjnych lub znakowanych sond. W QPCR ilość produktu PCR jest reprezentowana przez emitowane sygnały fluorescencyjne przez próbkę. RT PCR jest powszechnie stosowany jako proces amplifikacji, natomiast QPCR jest powszechnie stosowany jako proces kwantyfikacji. Jest to różnica między RT PCR a QPCR.

Bibliografia:
1. Deepak, SA, KR Kottapalli, R. Rakwal, G. Oros, KS Rangappa, H. Iwahashi, Y. Masuo i GK Agrawal. „PCR w czasie rzeczywistym: rewolucyjna analiza wykrywania i ekspresji genów”. Aktualna genomika. Bentham Science Publishers Ltd., czerwiec 2007. Internet. 03 kwietnia 2017 r
2. Zeka, Fjoralba, Katrien Vanderheyden, Els De Smet, Claude A. Cuvelier, Pieter Mestdagh i Jo Vandesompele. „Prosta i czuła analiza ekspresji genów próbek FFPE oparta na RT-qPCR.” Wiadomości natury. Nature Publishing Group, 22 lutego 2016 r. Sieć. 03 kwietnia 2017 r
3. Overbergh, L., A. Giulietti, D. Valckx, B. Decallonne, R. Bouillon i C. Mathieu. „Zastosowanie PCR z odwrotną transkryptazą w czasie rzeczywistym do oznaczania ekspresji genów cytokin.” Journal of Biomolecular Techniques: JBT. Association of Biomolecular Resource Facilities, marzec 2003. Web. 03 kwietnia 2017 r

Zdjęcie dzięki uprzejmości:
1. „Taqman” Autor: Braindamaged - Praca własna oryginalnego przesyłającego (domena publiczna) za pośrednictwem Commons Wikimedia
2. „Reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją” Autor: Jpark623 - Praca własna (CC BY-SA 3.0) przez Commons Wikimedia