Różnica między PCR a sekwencjonowaniem DNA

Kluczowa różnica - PCR vs. sekwencjonowanie DNA
 

Sekwencjonowanie PCR i DNA to dwie ważne techniki w biologii molekularnej. Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) to proces, który tworzy dużą liczbę kopii fragmentu DNA. Sekwencjonowanie DNA to technika, która daje dokładną kolejność nukleotydów danego fragmentu DNA. Jest to kluczowa różnica między PCR a sekwencjonowaniem DNA. PCR jest jednym z głównych etapów sekwencjonowania DNA.

ZAWARTOŚĆ
1. Przegląd i kluczowa różnica
2. Co to jest PCR
3. Co to jest sekwencjonowanie DNA
4. Porównanie obok siebie - PCR vs sekwencjonowanie DNA
5. Podsumowanie

Co to jest PCR?

Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) to technika amplifikacji DNA stosowana w biologii molekularnej. Wytwarza tysiące do milionów kopii określonego fragmentu DNA. Metodę tę opracował Kary Mullis w 1983 r. W tej technice fragment DNA do amplifikacji służy jako matryca, a enzym polimerazy DNA dodaje komplementarne nukleotydy do startera, który jest dostępny w mieszaninie PCR. Pod koniec reakcji PCR syntetyzuje się wiele kopii próbki DNA.

Istnieją różne składniki mieszaniny PCR, w tym DNA, polimeraza DNA (polimeraza Taq), startery (startery do przodu i do tyłu), nukleotydy (bloki budulcowe DNA) i bufor. PCR zachodzi wewnątrz maszyny do PCR, a właściwa mieszanina do PCR powinna zostać załadowana do maszyny i należy uruchomić odpowiedni program. Ta technika umożliwia produkcję tysięcy do milionów kopii określonego fragmentu DNA z bardzo małej ilości DNA.

Reakcje PCR zachodzą w sposób cykliczny z wytworzeniem widocznej ilości produktów PCR na żelu. Istnieją trzy główne etapy reakcji PCR, a mianowicie denaturacja, wyżarzanie startera i wydłużanie nici, jak pokazano na rycinie 01. Te trzy etapy zachodzą w trzech różnych temperaturach. DNA istnieje w postaci dwuniciowej poprzez wiązania wodorowe między komplementarnymi zasadami. Przed implikacją dwuniciowy DNA należy oddzielić od siebie. Odbywa się to przez podanie wysokiej temperatury. W wysokiej temperaturze, dwuniciowy DNA ulega denaturacji w pojedyncze nici. Następnie startery powinny zbliżyć się do flankujących końców specyficznego fragmentu lub genu DNA. Primer jest krótkim kawałkiem jednoniciowego DNA, który jest komplementarny do sekwencji docelowej. Startery do przodu i do tyłu startery z komplementarnymi zasadami na flankujących końcach zdenaturowanego DNA próbki w temperaturze hybrydyzacji. Podkłady powinny być odporne na ciepło. Po przyłączeniu starterów do próbki DNA, enzym polimerazy taq inicjuje syntezę nowych nici przez dodanie nukleotydów, które są komplementarne do docelowego DNA. Polimeraza Taq jest stabilnym termicznie enzymem izolowanym z bakterii termofilnej zwanej Thermus aquaticus. Bufor do PCR utrzymuje optymalne warunki działania polimerazy taq. Te trzy etapy reakcji PCR powtarza się, aby wytworzyć wymaganą ilość produktu PCR. Po każdej reakcji PCR liczba kopii DNA podwaja się. Stąd amplifikacja wykładnicza może być obserwowana w PCR. Produkty PCR można obserwować za pomocą elektroforezy żelowej i można je oczyścić do dalszych badań.

Rycina 01: Główne etapy reakcji PCR

PCR jest cennym narzędziem w badaniach medycznych i biologicznych. PCR ma szczególną wartość w kryminalistyce, ponieważ może amplifikować DNA do badań z drobnych próbek od przestępców i tworzyć profile DNA kryminalistyki. PCR jest szeroko stosowany w wielu obszarach biologii molekularnej, w tym w genotypowaniu, klonowaniu genów, wykrywaniu mutacji, sekwencjonowaniu DNA, mikromacierzach DNA i testach na ojcostwo itp..

Rycina 02: Reakcja łańcuchowa polimerazy

Co to jest sekwencjonowanie DNA?

Sekwencjonowanie DNA polega na określeniu dokładnej kolejności nukleotydów - adeniny, guaniny, cytozyny i tyminy w danym fragmencie DNA. Informacje genetyczne są przechowywane w sekwencjach DNA przy użyciu prawidłowej kolejności nukleotydów. Dlatego znalezienie dokładnej kolejności nukleotydów we fragmencie DNA jest bardzo ważne, aby wiedzieć o strukturze i funkcji genów.

Protokół sekwencjonowania DNA obejmuje różne procesy. Pierwszym krokiem jest izolacja zainteresowanego DNA lub genomowego DNA organizmu. Za pomocą PCR (jak opisano powyżej) pożądany region DNA powinien zostać powielony. Amplifikowany produkt PCR należy oddzielić metodą elektroforezy żelowej i oczyścić. Amplifikowane fragmenty służą jako szablony do sekwencjonowania. Sekwencjonowanie można wykonać albo zgodnie z sekwencjonowaniem Sanger, albo metodą sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Sekwencjonowanie Sangera wymaga elektroforezy kapilarnej powstałych fragmentów DNA. Określenie prawidłowej kolejności nukleotydów można wykonać poprzez ręczny odczyt autoradiografów lub za pomocą automatycznych sekwencerów DNA.

Sekwencjonowanie genów przyczyniło się do projektu Ludzkiego genomu i ułatwiło mapowanie ludzkiego genomu w 2003 r. W kryminalistyce sekwencjonowanie DNA umożliwiło identyfikację osobników wykazujących unikalne sekwencje DNA i identyfikujących przestępców. W medycynie sekwencjonowanie DNA można wykorzystać do wykrywania genów odpowiedzialnych za choroby genetyczne i inne, znajdowania wadliwych genów i zastępowania ich prawidłowymi genami. W rolnictwie informacje o sekwencjonowaniu DNA niektórych mikroorganizmów są wykorzystywane do produkcji roślin transgenicznych o pożądanych ekonomicznie cechach.

Rycina 03: Sekwencjonowanie DNA

Jaka jest różnica między PCR a sekwencjonowaniem DNA?

PCR a sekwencjonowanie DNA
Proces PCR tworzy tysiące do milionów kopii zainteresowanego fragmentu DNA.	Sekwencjonowanie DNA to proces określania dokładnej kolejności nukleotydów w danym fragmencie DNA.
Wynik
PCR tworzy tysiące do milionów kopii określonego fragmentu DNA	Powoduje to prawidłową kolejność zasad w określonym fragmencie DNA.
Zaangażowanie ddNTP
PCR nie wymaga ddNTP. Wykorzystuje dNTP.	Sekwencjonowanie DNA wymaga ddNTP do zakończenia tworzenia nici.

Podsumowanie - PCR vs sekwencjonowanie DNA

Sekwencjonowanie PCR i DNA jest bardzo ważnym narzędziem w wielu obszarach biologii molekularnej. Amplifikacja fragmentów DNA odbywa się techniką PCR, podczas gdy prawidłowa kolejność nukleotydów fragmentu DNA jest określana przez sekwencjonowanie DNA. To jest różnica między PCR a sekwencjonowaniem DNA.

Odniesienie:
1. „Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR).” Narodowe Centrum Informacji Biotechnologicznej. U.S. National Library of Medicine, n.d. Sieć. 21 lutego 2017 r.
2. Shendure, Jay i Hanlee Ji. „Sekwencjonowanie DNA nowej generacji”. Wiadomości natury. Nature Publishing Group, 09 października 2008. Web. 21 lutego 2017 r

Zdjęcie dzięki uprzejmości:
1. „Kroki PCR” Autor: Tinojasontran - Praca własna (domena publiczna) za pośrednictwem Commons Wikimedia
2. „Reakcja łańcuchowa polimerazy” Autor: Enzoklop - Praca własna (CC BY-SA 3.0) przez Commons Wikimedia
3. „Sekwencja DNA” Autor: Sjef - Praca własna (domena publiczna) za pośrednictwem Commons Wikimedia