Różnica między sekwencjonowaniem Sangera a sekwencjonowaniem pirotechnicznym

Kluczowa różnica - sekwencjonowanie Sangera i pirosekwencjonowanie
 

Sekwencjonowanie DNA jest bardzo ważne dla analizy DNA, ponieważ wiedza o prawidłowym rozmieszczeniu nukleotydów w danym regionie DNA ujawnia wiele ważnych informacji na jego temat. Istnieją różne metody sekwencjonowania DNA. Sekwencjonowanie Sanger i pirosekwencjonowanie to dwie różne metody sekwencjonowania DNA szeroko stosowane w biologii molekularnej. Kluczowa różnica między sekwencjonowaniem Sangera a sekwencjonowaniem pyrosekwencjonalnym jest taka Sekwencjonowanie Sangera wykorzystuje dideoksynukleotydy do zakończenia syntezy DNA w celu odczytania sekwencji nukleotydowej, natomiast pirosekwencjonowanie wykrywa uwalnianie pirofosforanu poprzez włączenie nukleotydów i syntezę sekwencji komplementarnej w celu odczytania dokładnej kolejności sekwencji.

ZAWARTOŚĆ
1. Przegląd i kluczowa różnica
2. Co to jest sekwencjonowanie Sanger
3. Co to jest pirosekwencjonowanie
4. Porównanie obok siebie - Sekwencjonowanie Sangera i pirosekwencjonowanie
5. Podsumowanie

Co to jest sekwencjonowanie Sanger?

Sekwencjonowanie Sanger to metoda sekwencjonowania DNA pierwszej generacji opracowana przez Fredericka Sangera i jego uczelnie w 1977 r. Jest także znana jako Sekwencjonowanie zakończeń łańcucha lub Sekwencjonowanie dideoksy ponieważ opiera się na zakończeniu łańcucha przez dideoksynukleotydy (ddNTP). Ta metoda była szeroko stosowana przez ponad 30 lat, dopóki nie opracowano sekwencjonowania nowej generacji (NGS). Technika sekwencjonowania Sanger umożliwiła odkrycie prawidłowej kolejności nukleotydów lub przyłączenie określonego fragmentu DNA. Opiera się na selektywnym włączaniu ddNTP i zakończeniu syntezy DNA podczas in vitro Replikacja DNA. Brak grup 3 'OH w celu kontynuowania tworzenia wiązania fosfodiestrowego między sąsiadującymi nukleotydami jest unikalną cechą ddNTP. Dlatego po dołączeniu ddNTP wydłużenie łańcucha ustaje i kończy się od tego momentu. Istnieją cztery ddNTP - ddATP, ddCTP, ddGTP i ddTTP - używane w sekwencjonowaniu Sangera. Te nukleotydy zatrzymują proces replikacji DNA, gdy są włączone do rosnącej nici DNA i dają różne długości krótkiego DNA. Elektroforezę na żelu kapilarnym stosuje się do uporządkowania tych krótkich nici DNA według ich wielkości na żelu, jak pokazano na rycinie 01.

Rycina 1: Elektroforeza na żelu kapilarnym zsyntetyzowanego krótkiego DNA

Dla in vitro replikacja DNA, należy przedstawić kilka wymagań. Są to enzym polimeraza DNA, matrycowe DNA, startery oligonukleotydowe i deoksynukleotydy (dNTP). W sekwencjonowaniu Sanger replikacja DNA przeprowadzana jest w czterech oddzielnych probówkach wraz z czterema typami ddNTP oddzielnie. Deoksynukleotydy nie są całkowicie zastąpione przez odpowiednie ddNTP. Mieszanina konkretnego dNTP (na przykład; dATP + ddATP) jest zawarta w probówce i replikowana. Cztery oddzielne produkty z probówki są prowadzone na żelu w czterech oddzielnych studzienkach. Następnie, czytając żel, sekwencję można skonstruować jak pokazano na rysunku 02.

Rysunek 02: Sekwencjonowanie Sanger

Sekwencjonowanie Sangera jest ważną techniką, która pomaga w wielu obszarach biologii molekularnej. Projekt genomu ludzkiego został pomyślnie zakończony za pomocą metod opartych na sekwencjonowaniu Sanger. Sekwencjonowanie Sanger jest również przydatne w sekwencjonowaniu docelowego DNA, badaniach raka i chorób genetycznych, analizie ekspresji genów, identyfikacji człowieka, wykrywaniu patogenów, sekwencjonowaniu drobnoustrojów itp..

Sekwencjonowanie Sangera ma kilka wad:

• Długość sekwencjonowanego DNA nie może być dłuższa niż 1000 par zasad
• Jednocześnie można zsekwencjonować tylko jedną nić.
• Proces ten jest czasochłonny i kosztowny.

Dlatego z czasem opracowano nowe zaawansowane techniki sekwencjonowania w celu przezwyciężenia tych problemów. Jednak sekwencjonowanie Sangera jest nadal w użyciu ze względu na jego bardzo dokładne wyniki do fragmentów o długości około 850 par zasad.

Co to jest pirosekwencjonowanie?

Pirosekwencjonowanie to nowa technika sekwencjonowania DNA oparta na „sekwencjonowaniu przez syntezę”. Ta technika polega na wykrywaniu uwalniania pirofosforanu po włączeniu nukleotydu. Proces ten jest wykorzystywany przez cztery różne enzymy: polimerazę DNA, sulfurylazę ATP, lucyferazę i apyrazę oraz dwa substraty fosfosiarczanu adenozyny 5 '(APS) i lucyferyny.

Proces rozpoczyna się od wiązania startera z matrycą jednoniciowego DNA, a polimeraza DNA rozpoczyna inkorporację nukleotydów komplementarnych do niego. Kiedy nukleotydy łączą się ze sobą (polimeryzacja kwasu nukleinowego), uwalnia pirofosforan (dwie połączone grupy fosforanowe) grupy i energię. Każdy dodatek nukleotydu uwalnia równomolową ilość pirofosforanu. Pirofosforan przekształca się w ATP przez sulfurylazę ATP w obecności substratu APS. Wygenerowany ATP napędza pośredniczoną przez lucyferazę konwersję lucyferyny do oksylocyferiny, wytwarzając światło widzialne w ilościach proporcjonalnych do ilości ATP. Światło jest wykrywane przez urządzenie wykrywające foton lub fotopowielacz i tworzy pirogram. Apyraza degraduje ATP i niewłączone dNTP w mieszaninie reakcyjnej. Dodawanie dNTP odbywa się jednorazowo. Ponieważ dodanie nukleotydu jest znane zgodnie z wprowadzaniem i wykrywaniem światła, można ustalić sekwencję matrycy. Pyrogram służy do generowania sekwencji nukleotydowej próbki DNA, jak pokazano na rycinie 03.

Pirosekwencjonowanie jest bardzo ważne w analizie polimorfizmu pojedynczego nukleotydu i sekwencjonowaniu krótkich odcinków DNA. Wysoka dokładność, elastyczność, łatwość automatyzacji i równoległe przetwarzanie to zalety pirosekwencjonowania w porównaniu z technikami sekwencjonowania Sanger.

Rycina 03: Pirosekwencjonowanie

Jaka jest różnica między sekwencjonowaniem Sanger a sekwencjonowaniem pyrosekwencjonowanym?

Sekwencjonowanie Sangera a sekwencjonowanie pyro
Sekwencjonowanie Sangera to metoda sekwencjonowania DNA oparta na selektywnym włączaniu ddNTP przez polimerazę DNA i zakończenie łańcucha.	Pirosekwencjonowanie to metoda sekwencjonowania DNA oparta na wykrywaniu uwalniania pirofosforanu po włączeniu nukleotydu.
Zastosowanie ddNTP
ddNTP są używane do zakończenia replikacji DNA	ddNTP nie są używane.
Zaangażowane enzymy
Zastosowano polimerazę DNA.	Stosuje się cztery enzymy: polimerazę DNA, sulfurylazę ATP, lucyferazę i apyrazę.
Użyte podłoża
APS i Lucyferin nie są używane.	Stosuje się fosforan adenozyny 5 '(APS) i lucyferynę.
Maksymalna temperatura
To powolny proces.	To szybki proces.

Podsumowanie - Sekwencjonowanie Sangera kontra pirosekwencjonowanie

Sekwencjonowanie Sanger i pirosekwencjonowanie to dwie metody sekwencjonowania DNA stosowane w biologii molekularnej. Sekwencjonowanie Sangera konstruuje kolejność nukleotydów w sekwencji przez zakończenie wydłużania łańcucha, podczas gdy pirosekwencjonowanie konstruuje dokładną kolejność nukleotydów w sekwencji przez włączenie nukleotydów i wykrywanie uwalniania pirofosforanów. Dlatego główna różnica między sekwencjonowaniem Sanger a sekwencjonowaniem pirolitycznym polega na tym, że sekwencjonowanie Sanger działa na sekwencjonowaniu poprzez zakończenie łańcucha, podczas gdy pirosekwencjonowanie działa na sekwencjonowaniu przez syntezę.

Odniesienie:
1. Fakruddin, Md i Abhijit Chowdhury. „Pirosekwencjonowanie - alternatywa dla tradycyjnego sekwencjonowania Sanger”. American Journal of Biochemistry and Biotechnology. Publikacje naukowe, 02 marca 2012 r. Internet. 28 lutego 2017 r.
2. „Sekwencjonowanie Sangera”. Sekwencjonowanie Sanger - tematy ScienceDirect. N.p., n.d. Sieć. 28 lutego 2017 r

Zdjęcie dzięki uprzejmości:
1. „Didesoxy-Methode” Christoph Goemans (modifiziert) - dr Norman Mauder, auf Basis einer Datei von Christoph Goemans (CC BY-SA 3.0) przez Commons Wikimedia
2. „Sanger-DNA-seq” Autor: Enzo z polskojęzycznej Wikipedii (CC BY-SA 3.0) przez Commons Wikimedia
3. „Pirosekwencjonowanie” przez mikrobiologię (CC BY-SA 2.0) przez Flickr