Różnica między Northern Southern i Western Blotting

Kluczowa różnica - Northern vs Southern vs Western Blotting
 

Wykrywanie określonych sekwencji DNA, RNA i białek jest niezbędne dla różnych rodzajów badań w biologii molekularnej. Elektroforeza żelowa to technika, która oddziela DNA, RNA i białka według ich wielkości. Z profili żelowych określoną sekwencję DNA, sekwencję RNA lub białko wykrywa się specjalnymi technikami zwanymi blottingiem i hybrydyzacją ze znakowanymi sondami. Istnieją trzy różne metody blottingu, a mianowicie południowy, północny i zachodni. Kluczowa różnica między północnym południowym a zachodnim biotem polega na rodzaju cząsteczki wykrywanej z próbki. Southern blotting to metoda, która wykrywa określoną sekwencję DNA z próbki DNA. Northern blotting to technika, która wykrywa określoną sekwencję RNA z próbki RNA. Western blotting to metoda, która wykrywa określone białko z próbki białka.

ZAWARTOŚĆ
1. Przegląd i kluczowa różnica
2. Co to jest Southern Blotting
3. Co to jest Northern Blotting
4. Co to jest Western Blotting
5. Porównanie obok siebie - Northern vs Southern vs Western Blotting
6. Podsumowanie

Co to jest Southern Blotting?

Technikę Southern blotting opracował E. M. Southern w 1975 roku w celu identyfikacji specyficznej sekwencji DNA z próbki DNA. Jest to pierwsza technika blottingowa wprowadzona w biologii molekularnej. Umożliwiło to wykrycie określonych genów z DNA, specyficznych fragmentów z DNA itp. Technika Southern blot obejmuje kilka etapów. Są one następujące.

1. DNA jest izolowane z próbki i trawione endonukleazami restrykcyjnymi.
2. Strawioną próbkę oddziela się za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.
3. Fragmenty DNA w żelu są denaturowane do pojedynczych nici za pomocą roztworu alkalicznego.
4. Jednoniciowy DNA jest przenoszony na membranę filtracyjną nitrocelulozową przez przenoszenie kapilarne.
5. Przeniesiony DNA jest trwale przymocowany do błony.
6. Naprawione DNA na błonie jest hybrydyzowane ze znakowanymi sondami.
7. Niezwiązane DNA jest wymywane z błony przez płukanie.
8. Film rentgenowski wystawia się na działanie błony i przygotowuje autoradiograf.

Metoda Southern blotting jest stosowana do różnych aspektów biologii molekularnej. Jest przydatny w mapowaniu RFLP, badaniach kryminalistycznych, metylacji DNA w ekspresji genów, wykrywaniu zmutowanych genów w zaburzeniach genetycznych, odciskach palców DNA itp..

Ryc. 01: Technika Southern Blotting

Co to jest Northern Blotting?

Northern blotting to metoda zaprojektowana do wykrywania określonej sekwencji RNA lub sekwencji mRNA z próbki w celu zbadania ekspresji genów. Technikę tę opracowali Alwine, Kemp i Stark w 1979 roku. Różni się ona od technik sourthern i western blotting ze względu na kilka etapów. Jednak tę technikę wykonuje się również poprzez elektroforezę żelową, blotting i hybrydyzację ze specyficznie znakowanymi sondami i wykrywanie. Technikę Northern blot wykonuje się w następujący sposób.

1. RNA jest ekstrahowany z próbki i oddzielany za pomocą elektroforezy żelowej.
2. RNA przenosi się z żelu na błonę bibułową i utrwala.
3. Membranę traktuje się znakowaną sondą przygotowaną z cDNA lub RNA (sonda jest komplementarna do określonej sekwencji w próbce).
4. Sondę inkubuje się z błoną, aby związać się z określoną sekwencją.
5. Niezwiązane sondy są zmywane.
6. Zhybrydyzowane fragmenty są wykrywane przez autoradiograf.

Northern blotting jest ważnym narzędziem w wykrywaniu i analizie ilościowej hybrydyzowanego mRNA, badaniu degradacji RNA, ocenie okresu półtrwania RNA, wykrywaniu składania RNA, badaniu ekspresji genów itp..

Ryc. 02: Northern Blotting

Co to jest Western Blotting?

Western blotting to metoda wykrywania określonego białka z mieszaniny białek za pomocą znakowanego przeciwciała. Dlatego western blot jest również znany jako immunoblot. Technikę tę wprowadził Towbin i in w 1979 r. i obecnie jest rutynowo przeprowadzany w laboratoriach do analizy białek. Kroki są następujące.

1. Białka są ekstrahowane z próbki
2. Białka są rozdzielane według ich wielkości za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym
3. Oddzielone cząsteczki przenosi się na membranę PVDF lub membranę nitrocelulozową przez elektroporację
4. Błona jest zablokowana dla niespecyficznego wiązania z przeciwciałami
5. Przeniesione białka są związane z pierwotnym przeciwciałem (przeciwciała znakowane enzymem).
6. Membranę przemywa się w celu usunięcia niespecyficznie związanych pierwotnych przeciwciał
7. Związane przeciwciała wykrywa się przez dodanie substratu i wykrycie utworzonego zabarwionego osadu

Analiza Western jest użyteczna w wykrywaniu przeciwciał anty-HIV w próbce surowicy ludzkiej. Western blot może być również stosowany jako test potwierdzający zakażenie wirusem zapalenia wątroby typu B i ostateczny test na chorobę szalonych krów.

Rycina 03: Western Blotting

Jaka jest różnica między Northern Southern i Western Blotting?

Northern vs Southern vs Western Blotting
Rodzaj wykrytej cząsteczki
Northern Blotting	Northern blot wykrywa określoną sekwencję RNA z próbki RNA.
Southern Blotting	Metoda Southern blot wykrywa określoną sekwencję DNA z próbki DNA.
Western Blotting	Western blot wykrywa określone białko z próbki białka.
Rodzaj żelu
Northern Blotting	Wykorzystuje to żel agarozowy / formaldehydowy.
Southern Blotting	To używa żelu agarozowego.
Western Blotting	To wykorzystuje żel poliakryloamidowy.
Metoda kleksowa
Northern Blotting	To jest transfer kapilarny.
Southern Blotting	To jest transfer kapilarny.
Western Blotting	To jest transfer elektryczny.
Używane sondy
Northern Blotting	Sondy cDNA lub RNA znakowane radioaktywnie lub nieradioaktywnie.
Southern Blotting	Sondy DNA są znakowane radioaktywnie lub nieradioaktywnie.
Western Blotting	Pierwotne przeciwciała są stosowane jako sondy.
System wykrywania
Northern Blotting	Odbywa się to za pomocą autoradiografu lub detekcji zmiany światła lub koloru.
Southern Blotting	Odbywa się to za pomocą autoradiografu, wykrywania światła lub zmiany koloru.
Western Blotting	Odbywa się to za pomocą detekcji zmiany światła lub koloru.

Podsumowanie - Northern vs Southern vs Western Blotting

Blotting to specjalna technika opracowana w celu identyfikacji specyficznego DNA, RNA lub białka z próbek. Istnieją trzy oddzielne procedury blottingu, a mianowicie północna, południowa i zachodnia, w celu wykrycia określonego rodzaju cząsteczki. Technika Northern blotting ma na celu wykrycie określonej sekwencji RNA z mieszaniny RNA. Metoda Southern blotting umożliwia wykrycie określonej sekwencji DNA z próbki DNA, a technika western blotting została opracowana w celu identyfikacji konkretnego białka z mieszaniny białek.

Bibliografia
1. Gibbons, Janay. „Western Blot: przegląd transferu białek”. North American Journal of Medical Sciences. Medknow Publications & Media Pvt Ltd, marzec 2014. Internet. 27 marca 2017 r
2. Brown, T. „Southern blotting”. Aktualne protokoły w immunologii. U.S. National Library of Medicine, maj 2001. Web. 27 marca 2017 r
3. On, Shan L. „Northern blot”. Metody w enzymologii. U.S. National Library of Medicine, 2013. Web. 27 marca 2017 r

Zdjęcie dzięki uprzejmości:
1. „Program Northern Blot” Autor: RNA405 - Praca własna (domena publiczna) za pośrednictwem Commons Wikimedia
2. „Western blot 114A” Autor: Amanthabagdon - Praca własna (domena publiczna) za pośrednictwem Commons Wikimedia