Różnica między NGS a sekwencjami Sanger

Kluczowa różnica - NGS vs. Sanger Sequencing
 

Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) i sekwencjonowanie Sanger to dwa rodzaje technik sekwencjonowania nukleotydów opracowanych w czasie. Metoda sekwencjonowania Sangera była szeroko stosowana przez wiele lat, a NGS zastąpiła ją niedawno ze względu na swoje zalety. Kluczowa różnica między NGS a sekwencjami Sanger polega na tym NGS działa na zasadzie sekwencjonowania milionów sekwencji jednocześnie w szybki sposób przez system sekwencjonowania, podczas gdy Sanger Sequencing działa na zasadzie zakończenia łańcucha z powodu selektywnego włączenia dideoksynukleotydów przez enzym polimerazę DNA podczas replikacji DNA i wynikającego z tego rozdziału fragmentów kapilarnych elektroforeza.

ZAWARTOŚĆ
1. Przegląd i kluczowa różnica
2. Co to jest sekwencjonowanie nukleotydów
3. Co to jest NGS
4. Co to jest sekwencjonowanie Sanger
5. Porównanie obok siebie - NGS vs. Sanger Sequencing
6. Podsumowanie

Co to jest sekwencjonowanie nukleotydów?

Informacja genetyczna jest przechowywana w sekwencjach nukleotydowych DNA lub RNA organizmu. Proces określania prawidłowej kolejności nukleotydów (przy użyciu czterech zasad) w danym fragmencie (w genie, klastrze genów, chromosomie i pełnym genomie) jest znany jako sekwencjonowanie nukleotydów. W badaniach genomicznych, kryminalistycznych, wirusologii, systematycznej biologii, diagnostyce medycznej, biotechnologii i wielu innych dziedzinach bardzo ważna jest analiza struktury i funkcji genów. Istnieją różne rodzaje metod sekwencjonowania opracowanych przez naukowców. Pomiędzy nimi, Sekwencjonowanie Sanger opracowany przez Fredericka Sangera w 1977 roku był szeroko stosowany i spopularyzowany przez długi czas do Sekwencjonowanie nowej generacji zastąpił to.

Co to jest NGS?

Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) to termin używany w odniesieniu do nowoczesnych procesów sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Opisuje szereg różnych nowoczesnych technologii sekwencjonowania, które zrewolucjonizowały badania genomiczne i biologię molekularną. Te techniki to sekwencjonowanie Illumina, sekwencjonowanie Roche 454, sekwencjonowanie protonów jonowych i sekwencjonowanie SOLiD (Sequencing by Oligo Ligation Detection). Systemy NGS są szybsze i tańsze. W systemach NGS stosuje się cztery główne metody sekwencjonowania DNA, a mianowicie; pirosekwencjonowanie, sekwencjonowanie przez syntezę, sekwencjonowanie przez ligację i sekwencjonowanie półprzewodników jonowych. Dużą liczbę nici DNA lub RNA (miliony) można sekwencjonować równolegle. Umożliwia sekwencjonowanie całego genomu organizmów w krótkim okresie czasu, w przeciwieństwie do sekwencjonowania Sangera, które zajmuje więcej czasu.

NGS ma wiele zalet w porównaniu z konwencjonalną metodą sekwencjonowania Sangera. Jest to szybki, bardziej dokładny i opłacalny proces, który można przeprowadzić przy małej wielkości próbki. NGS może być stosowany w badaniach metagenomicznych, w wykrywaniu zmian w obrębie pojedynczego genomu w wyniku insercji i delecji itp. Oraz w analizie ekspresji genów.

Rysunek_1: Zmiany w sekwencjonowaniu NGS

Co to jest sekwencjonowanie Sanger?

Sekwencjonowanie Sanger to metoda sekwencjonowania opracowana przez Fredericka Sangera i jego współpracowników w 1977 r. W celu ustalenia dokładnej kolejności nukleotydów danego fragmentu DNA. Jest również znany jako sekwencjonowanie terminacji łańcucha lub Sekwencjonowanie dideoksy. Zasada działania tej metody polega na zakończeniu syntezy nici przez selektywne włączenie dideoksynukleotydów kończących łańcuch (ddNTP), takich jak ddGTP, ddCTP, ddATP i ddTTP przez polimerazę DNA podczas replikacji DNA. Normalne nukleotydy mają grupy 3 'OH do tworzenia wiązania fosfodiestrowego między sąsiadującymi nukleotydami, aby kontynuować tworzenie nici. Jednak ddNTP nie mają tej grupy 3 'OH i nie są zdolne do tworzenia wiązań fosfodiestrowych między nukleotydami. W związku z tym wydłużenie łańcucha ustało.

W tej metodzie sekwencjonowany jednoniciowy DNA służy jako nić matrycy in vitro Synteza DNA. Inne wymagania to starter oligonukleotydowy, prekursory deoksynukleotydowe i enzym polimerazy DNA. Kiedy znane są flankujące końce docelowego fragmentu, startery można łatwo zaprojektować do replikacji DNA. Cztery oddzielne reakcje syntezy DNA przeprowadza się w czterech oddzielnych probówkach. Każda rura ma osobne ddNTP, wraz z innymi wymaganiami. Z konkretnego nukleotydu dodaje się mieszaninę dNTP i ddNTP. Podobnie, cztery oddzielne reakcje przeprowadza się w czterech probówkach z czterema mieszaninami. Po reakcjach wykonuje się wykrywanie fragmentów DNA i konwersję wzoru fragmentu na informację o sekwencji. Powstałe fragmenty DNA są denaturowane termicznie i rozdzielane za pomocą elektroforezy żelowej. Jeśli stosuje się radioaktywne nukleotydy, wzór pasmowania w żelu poliakryloamidowym można wizualizować za pomocą autoradiografii. Gdy ta metoda wykorzystuje fluorescencyjnie znakowane dideoksynukleotydy, można je zminimalizować w dół odczytanego żelu i przepuścić przez wiązkę lasera, która zostanie wykryta przez detektor fluorescencyjny. Aby uniknąć błędów, które mogą wystąpić, gdy sekwencja jest odczytywana przez oko i wprowadzana ręcznie do komputera, ta metoda rozwinęła się w zastosowanie automatycznego sekwencera połączonego z komputerem.

Jest to metoda stosowana do sekwencjonowania DNA z projektu Human Genome. Ta metoda jest nadal używana z zaawansowanymi modyfikacjami, ponieważ zapewnia dokładne informacje o sekwencji, mimo że jest to kosztowny i powolny proces.

Figure_2: Sekwencjonowanie Sangera

Jaka jest różnica między NGS a sekwencjami Sanger?

Sekwencjonowanie NGS a Sanger
Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) odnosi się do nowoczesnych wysokowydajnych procesów sekwencjonowania. Opisuje szereg różnych nowoczesnych technologii sekwencjonowania	Sekwencjonowanie Sanger to metoda sekwencjonowania opracowana przez Fredericka Sangera w celu określenia dokładnej kolejności nukleotydów danego fragmentu DNA.
Opłacalność
NGS jest tańszym procesem, ponieważ zmniejsza czas, siłę roboczą i chemikalia.	Jest to kosztowny proces, ponieważ wymaga czasu, siły ludzkiej i większej ilości chemikaliów.
Prędkość
Jest to szybsze, ponieważ zarówno detekcja chemiczna, jak i detekcja sygnału wielu pasm zachodzą równolegle.	Jest to czasochłonne, ponieważ wykrywanie substancji chemicznych i wykrywanie sygnału odbywa się jako dwa oddzielne procesy i tylko na pasmach można odczytać naraz.
Niezawodność
NGS jest niezawodny.	Sekwencjonowanie Sangera jest mniej niezawodne
Wielkość próbki
NGS wymaga mniejszej ilości DNA.	Ta metoda wymaga dużej ilości szablonu DNA.
Zasady DNA na sekwencjonowany fragment
Liczba zasad DNA na zsekwencjonowany fragment jest niższa niż metoda Sangera	Sekwencje generujące są dłuższe niż sekwencje NGS.

Podsumowanie - NGS vs. Sanger Sequencing

Sekwencjonowanie NGS i Sanger to techniki sekwencjonowania nukleotydów szeroko stosowane w biologii molekularnej. Sekwencjonowanie Sanger to wczesna metoda sekwencjonowania, którą zastąpiono NGS. Główną różnicą między NGS a sekwencjonowaniem Sanger jest to, że NGS jest szybkim, dokładniejszym i opłacalnym procesem niż sekwencjonowanie Sanger. Obie techniki spowodowały poważne wybuchy genetyki i biotechnologii.

Odniesienie:
1. Nowrousian, Minou. „Techniki sekwencjonowania nowej generacji dla mikroorganizmów eukariotycznych: rozwiązania problemów biologicznych oparte na sekwencjonowaniu”. Komórka Eukariotyczna. American Society for Microbiology, wrzesień 2010. Web. 18 lutego 2017 r
2. Sanger, F., S. Nicklen i A. R. Coulson. „Sekwencjonowanie DNA z inhibitorami kończącymi łańcuch”. Postępowania z National Academy of Sciences 74.12 (1977): 5463-467. Sieć.
3. Liu, Lin, Yinhu Li, Siliang Li, Ni Hu, Yimin He, Ray Pong, Danni Lin, Lihua Lu i Maggie Law. „Porównanie systemów sekwencjonowania nowej generacji”. Journal of Biomedicine and Biotechnology 2012 (2012): 1-11. Sieć.

Zdjęcie dzięki uprzejmości:
„Sekwencjonowanie Sangera” Autor: Estevezj - Praca własna (CC BY-SA 3.0) przez Commons Wikimedia 
„Rozwój w sekwencjonowaniu nowej generacji” Autor: Nederbragt, Lex (2012) - (CC BY 3.0) przez Commons Wikimedia