Różnica między mikromacierzem a sekwencjonowaniem RNA

Kluczowa różnica - mikromacierz a sekwencjonowanie RNA
 

Transkryptom reprezentuje całą zawartość RNA obecnego w komórce, w tym mRNA, rRNA, tRNA, zdegradowany RNA i nierozłożony RNA. Profilowanie transkryptomu jest ważnym procesem w celu zrozumienia wglądu w komórki. Istnieje kilka zaawansowanych metod profilowania transkryptomu. Sekwencjonowanie mikromacierzy i RNA to dwa rodzaje technologii opracowane do analizy transkryptomu. Kluczowa różnica między sekwencjonowaniem mikromacierzy i RNA jest taka mikromacierz opiera się na potencjale hybrydyzacji wstępnie zaprojektowanych znakowanych sond z docelowymi sekwencjami cDNA, podczas gdy sekwencjonowanie RNA opiera się na bezpośrednim sekwencjonowaniu nici cDNA za pomocą zaawansowanych technik sekwencjonowania, takich jak NGS. Mikromacierz wykonuje się z uprzednią wiedzą o sekwencjach, a sekwencjonowanie RNA przeprowadza się bez uprzedniej wiedzy o sekwencjach.

ZAWARTOŚĆ
1. Przegląd i kluczowa różnica
2. Co to jest mikromacierz
3. Co to jest sekwencjonowanie RNA
4. Porównanie obok siebie - mikromacierz vs sekwencjonowanie RNA
5. Podsumowanie

Co to jest Microarray?

Mikromacierz jest solidną, niezawodną i wysokoprzepustową metodą stosowaną przez naukowców do profilowania transkryptomu. Jest to najbardziej popularne podejście do analizy transkryptów. Jest to tania metoda, która zależy od sond hybrydyzacyjnych.

Technika rozpoczyna się od ekstrakcji mRNA z próbki i budowy biblioteki cDNA z całkowitego RNA. Następnie miesza się go ze znakowanymi fluorescencyjnie wstępnie zaprojektowanymi sondami na stałej powierzchni (matryca punktowa). Sekwencje komplementarne hybrydyzują ze znakowanymi sondami w mikromacierzy. Następnie mikromacierz jest myta i przesiewana, a obraz kwantyfikowany. Zebrane dane należy przeanalizować, aby uzyskać względne profile ekspresji.

Zakłada się, że intensywność sond mikromacierzy jest proporcjonalna do ilości transkryptów w próbce. Jednak dokładność techniki zależy od zaprojektowanych sond, wcześniejszej wiedzy o sekwencji i powinowactwa sond do hybrydyzacji. Stąd technologia mikromacierzy ma ograniczenia. Techniki mikromacierzy nie można wykonać z transkryptami o niskiej liczebności. Nie różnicuje izoform i nie identyfikuje wariantów genetycznych. Ponieważ ta metoda zależy od hybrydyzacji sond, w technice mikromacierzy występują pewne problemy związane z hybrydyzacją, takie jak hybrydyzacja krzyżowa, hybrydyzacja niespecyficzna itp..

Rysunek 01: Mikromacierz

Co to jest sekwencjonowanie RNA?

Sekwencjonowanie strzelby RNA (Sekwencja RNA) to niedawno opracowana technika sekwencjonowania całego transkryptomu. Jest to szybka i wysokoprzepustowa metoda profilowania transkryptomu. Bezpośrednio określa ilościowo ekspresję genów i prowadzi do głębokich badań transkryptomu. Sekwencja RNA nie zależy od wcześniej zaprojektowanych sond ani wcześniejszej wiedzy o sekwencjach. Dlatego metoda sekwencyjna RNA ma wysoką czułość i zdolność wykrywania nowych genów i wariantów genetycznych.

Metodę sekwencjonowania RNA przeprowadza się w kilku etapach. Całkowity RNA komórki musi zostać wyizolowany i pofragmentowany. Następnie, używając odwrotnej transkryptazy, należy przygotować bibliotekę cDNA. Każda nić cDNA musi być zligowana z adapterami. Następnie zligowane fragmenty należy zamplifikować i oczyścić. Wreszcie przy użyciu metody NGS należy przeprowadzić sekwencjonowanie cDNA.

Rycina 02: Sekwencjonowanie RNA

Jaka jest różnica między mikromacierzem a sekwencjonowaniem RNA?

Mikromacierz a sekwencjonowanie RNA
Mikromacierz jest solidną, niezawodną i wysokoprzepustową metodą.	Sekwencjonowanie RNA jest dokładną i wysokoprzepustową metodą.
Koszt
To jest tania metoda.	To droga metoda.
Analiza dużej liczby próbek
Ułatwia to analizowanie dużej liczby próbek jednocześnie.	Ułatwia to analizę dużej liczby próbek.
Analiza danych
Analiza danych jest złożona.	W tej metodzie generowanych jest więcej danych; dlatego proces jest bardziej złożony.
Wcześniejsza znajomość sekwencji
Ta metoda oparta jest na sondach hybrydyzacyjnych, więc wymagana jest wcześniejsza znajomość sekwencji.	Ta metoda nie zależy od wiedzy o poprzedniej sekwencji.
Wariacje strukturalne i nowe geny
Ta metoda nie może wykryć zmian strukturalnych i nowych genów.	Ta metoda może wykrywać zmiany strukturalne, takie jak łączenie genów, alternatywne składanie i nowe geny.
Wrażliwość
Nie można wykryć różnic w ekspresji izoform, więc ma to ograniczoną czułość.	Ma to wysoką czułość.
Wynik
Może to tylko skutkować względnymi poziomami ekspresji. Nie daje to bezwzględnej kwantyfikacji ekspresji genów.	Daje bezwzględne i względne poziomy ekspresji.
Ponowna analiza danych
Należy to ponownie uruchomić, aby przeprowadzić ponowną analizę.	Dane sekwencjonowania można ponownie analizować.
Potrzeba określonego personelu i infrastruktury
Specjalna infrastruktura i personel nie są wymagane w przypadku mikromacierzy.	Specjalna infrastruktura i personel wymagany do sekwencjonowania RNA.
Problemy techniczne
Technika mikromacierzy ma problemy techniczne, takie jak hybrydyzacja krzyżowa, hybrydyzacja niespecyficzna, ograniczona szybkość wykrywania poszczególnych sond itp..	Technika sekwencyjna RNA pozwala uniknąć problemów technicznych, takich jak hybrydyzacja krzyżowa, hybrydyzacja niespecyficzna, ograniczona częstotliwość wykrywania poszczególnych sond itp..
Biases
Jest to metoda stronnicza, ponieważ zależy od hybrydyzacji.	Odchylenie jest niskie w porównaniu do mikromacierzy.

Podsumowanie - mikromacierz a sekwencjonowanie RNA

Metody sekwencjonowania mikromacierzy i RNA to platformy o wysokiej przepustowości opracowane do profilowania transkryptomu. Obie metody dają wyniki wysoce skorelowane z profilami ekspresji genów. Jednak sekwencjonowanie RNA ma przewagę nad mikromacierzem w analizie ekspresji genów. Sekwencjonowanie RNA jest bardziej czułą metodą wykrywania transkryptów o niskiej obfitości niż mikromacierz. Sekwencjonowanie RNA umożliwia także różnicowanie między izoformami i identyfikację wariantów genów. Jednak mikromacierz jest powszechnym wyborem większości badaczy, ponieważ sekwencjonowanie RNA jest nową i kosztowną techniką z wyzwaniami przechowywania danych i złożoną analizą danych.

Bibliografia:
1.Wang, Zhong, Mark Gerstein i Michael Snyder. „RNA-Seq: rewolucyjne narzędzie do transkryptomiki”. Recenzje przyrody. Genetyka. U.S. National Library of Medicine, styczeń 2009. Web. 14 marca 2017 r
2.Rogler, Charles E., Tatyana Czajkowska, Raquel Norel, Aldo Massimi, Christopher Plescia, Eugeny Rubashevsky, Paul Siebert i Leslie E. Rogler. „Mikromacierze ekspresji RNA (REM), wysokoprzepustowa metoda pomiaru różnic w ekspresji genów w różnych próbkach biologicznych.” Badania nad kwasami nukleinowymi. Oxford University Press, 01 stycznia 2004. Web. 15 marca 2017 r
3.Zhao, Shanrong, Wai-Ping Fung-Leung, Anton Bittner, Karen Ngo i Xuejun Liu. „Porównanie sekwencji RNA i mikromacierzy w profilowaniu transkryptomu aktywowanych komórek T”. PLOS ONE. Public Library of Science, styczeń 2014. Web. 15 marca 2017 r

Zdjęcie dzięki uprzejmości:
1. „Journal.pcbi.1004393.g002” Autor: Malachi Griffith, Jason R. Walker, Nicholas C. Spies, Benjamin J. Ainscough, Obi L. Griffith - (CC BY 2.5) przez Commons Wikimedia
2. „Microarray” autorstwa Billa Bransona (fotografa) - National Cancer Institute (domena publiczna) za pośrednictwem Commons Wikimedia