Różnica między Maxamem Gilbertem a sekwencją Sanger

Kluczowa różnica - Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
 

Nukleotydy są podstawowymi jednostkami strukturalnymi i blokami budulcowymi DNA. Cząsteczka DNA składa się z łańcucha polinukleotydowego. Istnieją cztery różne nukleotydy znalezione w DNA. Te nukleotydy składają się z czterech różnych zasad azotowych o nazwie A (adenina), G (guanina), C (cytozyna), T (tymina). Kolejność nukleotydów w cząsteczce DNA ma ogromne znaczenie, ponieważ koduje ważną informację genetyczną dla wzrostu i rozwoju organizmów. Sekwencjonowanie DNA odnosi się do procesu, który określa dokładną sekwencję nukleotydową DNA. Istnieją różne metody sekwencjonowania DNA. Sekwencjonowanie Maxama Gilberta i sekwencjonowanie DNA Sanger to dwie metody sekwencjonowania DNA, które należą do sekwencjonowania pierwszej generacji. Procedura sekwencjonowania Maxama Gilberta określa sekwencję zasad przez chemiczne cięcie fragmentów DNA znakowanych na końcu 5 'preferencyjnie przy każdym z czterech nukleotydów i elektroforezie żelowej. Procedura sekwencjonowania Sanger określa sekwencję nukleotydową poprzez syntezę jednoniciowego DNA przy użyciu polimerazy DNA i dideoksynukleotydów oraz elektroforezy żelowej. Jest to kluczowa różnica między Maxam Gilbert a Sanger Sequencing.

ZAWARTOŚĆ
1. Przegląd i kluczowa różnica
2. Co to jest Maxam Gilbert
3. Co to jest sekwencjonowanie Sanger
4. Porównanie obok siebie - Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
5. Podsumowanie

Co to jest sekwencjonowanie Maxama Gilberta?

Sekwencjonowanie Maxama Gilberta, znane również jako metoda sekwencjonowania chemicznego, to technika opracowana w celu określenia kolejności nukleotydów w DNA. Ta metoda została wprowadzona przez Waltera Gilberta i Alana Maxama w 1976 roku i stała się popularna, ponieważ można ją wykonać bezpośrednio z oczyszczonym DNA. Metoda Maxama Gilberta należy do pierwszej generacji sekwencjonowania DNA i była to pierwsza metoda sekwencjonowania stosowana powszechnie przez naukowców.

Podstawowa zasada tej metody polega na ograniczeniu znakowanych na końcu fragmentów DNA przy określonych zasadach chemikaliami i warunkami specyficznymi dla zasady oraz rozdzieleniu znakowanych fragmentów za pomocą elektroforezy, jak pokazano na rysunku 01. Fragmenty są rozdzielane zgodnie z ich wielkościami na żel. Ponieważ fragmenty są znakowane, można łatwo wydedukować sekwencję cząsteczki DNA.

Metoda Maxama Gilberta wykorzystuje chemikalia specyficzne dla zasady, aby rozbić DNA na określonych zasadach. Dwie popularne chemikalia zwane siarczanem dimetylu i hydrazyną stosowane są do selektywnego atakowania odpowiednio puryn i pirymidyn.

Metodę sekwencjonowania Maxama Gilberta przeprowadza się w kilku etapach w następujący sposób.

1. Oczyszczanie sekwencji DNA przy użyciu endonukleaz restrykcyjnych
2. Znakowanie końców fragmentów DNA przez dodanie radioaktywnych fosforanów
3. Oczyszczanie znakowanych fragmentów z nieznakowanych fragmentów metodą elektroforezy żelowej
4. Rozdzielenie DNA znakowanego na końcu na cztery probówki i oddzielne traktowanie chemikaliami specyficznymi dla zasady
5. Elektroforeza zawartości każdej probówki na osobnych liniach na żelu i rozdział fragmentów zgodnie z ich długością.
6. Wykrywanie fragmentów przez autoradiograf.

Rysunek 01: Sekwencjonowanie Maxama Gilberta

Co to jest sekwencjonowanie Sanger?

Sekwencjonowanie Sanger to metoda sekwencjonowania opracowana przez Fredericka Sangera i jego współpracowników w 1977 r. W celu ustalenia sekwencji podstawowej danego fragmentu DNA. Jest również znany jako sekwencjonowanie terminacji łańcucha lub Metoda sekwencjonowania dideoksy. Ta metoda działa na zasadzie selektywnego włączania dideoksynukleotydów kończących łańcuch (ddNTP), takich jak ddGTP, ddCTP, ddATP i ddTTP przez polimerazę DNA podczas syntezy jednoniciowego DNA w celu zakończenia tworzenia nici. W dideoksynukleotydach brakuje grup 3 'OH do tworzenia wiązań fosfodiestrowych z sąsiednim nukleotydem. Zatem tworzenie nici ustaje, gdy ddNTP zostanie włączony do nowo tworzonej nici podczas sekwencjonowania sanger.

W tej metodzie cztery oddzielne reakcje syntezy DNA (PCR) przeprowadza się w czterech oddzielnych probówkach z jednym rodzajem ddNTP. Dostarczono również inne wymagania dla probówek do PCR, w tym starterów, dNTP, polimerazy Taq, specyficzne warunki itp. Cztery oddzielne reakcje przeprowadza się w czterech probówkach z czterema mieszaninami. Po reakcjach PCR powstałe fragmenty DNA są denaturowane termicznie i rozdzielane za pomocą elektroforezy żelowej. Następnie fragmenty są wizualizowane za pomocą znakowanego (radioaktywnego lub fluorescencyjnego) startera lub dNTP, jak pokazano na rysunku 02.

Rysunek 02: Sekwencjonowanie Sangera

Jaka jest różnica między Maxam Gilbert a Sanger Sequencing?

Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
Sekwencjonowanie Maxama Gilberta to pierwsza technika opracowana do sekwencjonowania DNA.	Metoda sekwencjonowania Sanger została wprowadzona po metodzie sekwencjonowania Maxama Gilberta.
Stosowanie
Ta metoda jest rzadko stosowana.	Sekwencjonowanie Sanger jest rutynowo stosowane do sekwencjonowania.
Zastosowanie niebezpiecznych substancji chemicznych
Wykorzystuje niebezpieczne chemikalia.	Stosowanie niebezpiecznych chemikaliów jest ograniczone w porównaniu z metodą Maxama Gilberta.
Etykietowanie w celu wykrycia
Ta metoda wykorzystuje radioaktywny P.32 do znakowania końców fragmentów DNA.	Sekwencjonowanie Sangera wykorzystuje ddNTP znakowane radioaktywnie lub fluorescencyjnie.

Podsumowanie - Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing

Sekwencjonowanie Maxama Gilberta i Sangera to dwa rodzaje technik sekwencjonowania DNA objętych sekwencjonowaniem DNA pierwszej generacji. Sekwencjonowanie Maxama Gilberta to pierwsza metoda wprowadzona do sekwencjonowania DNA w 1976 r. I jest przeprowadzana przez rozbicie fragmentów DNA znakowanych na końcu chemikaliami specyficznymi dla zasady. Dlatego jest znany jako sekwencjonowanie chemiczne. Metodę sekwencjonowania Sanger wprowadzono w 1977 r. I opiera się ona na reakcjach zakończenia łańcucha kierowanych przez ddNTP. Metoda sekwencjonowania Sanger popularna niż metoda Maxama Gilberta ze względu na kilka wad metody Maxama Gilberta, takich jak nadmierne zużycie czasu, stosowanie niebezpiecznych chemikaliów itp. Jest to różnica między sekwencjonowaniem Maxama Gilberta i sekwencjonowaniem Sanger.

Bibliografia:
1.Maxam, A.M i Walter Gilbert. „Nowa metoda sekwencjonowania DNA.” Materiały z National Academy of Sciences. National Acad Sciences, 9 grudnia 1976. Web. 30 marca 2017 r
2. Heather, James M. i Benjamin Chain. „Sekwencja sekwencerów: historia sekwencjonowania DNA.” Genomika. Academic Press, styczeń 2016. Internet. 30 marca 2017 r
3.Pareek, Chandra Shekhar, Rafal Smoczyński i Andrzej Tretyn. „Technologie sekwencjonowania i sekwencjonowania genomu”. Journal of Applied Genetics. Springer-Verlag, listopad 2011. Internet. 30 marca 2017 r

Zdjęcie dzięki uprzejmości:
1. „Sekwencjonowanie Maxama Gilberta” autorstwa Kilka razy z angielskiej Wikipedii (CC BY 3.0) przez Commons Wikimedia
2. „Sekwencjonowanie Sangera” Autor: Estevezj - Praca własna (CC BY-SA 3.0) przez Commons Wikimedia