Różnica między klonowaniem genów a PCR

Kluczowa różnica - klonowanie genów vs PCR
 

Synteza wielu kopii DNA z określonego fragmentu DNA nazywa się amplifikacją DNA. Istnieją dwa główne procesy amplifikacji DNA, a mianowicie klonowanie genów i PCR. Kluczową różnicą między klonowaniem genów a PCR jest, klonowanie genów daje wiele kopii konkretnego genu in vivo przez konstruowanie rekombinowanego DNA i wzrost wewnątrz bakterii gospodarza, podczas gdy PCR wytwarza miliony kopii określonego fragmentu DNA in vitro poddawanych powtarzającym się cyklom denaturacji i syntezy.

ZAWARTOŚĆ
1. Przegląd i kluczowa różnica
2. Co to jest klonowanie genów
3. Co to jest PCR
4. Porównanie obok siebie - klonowanie genów vs PCR
5. Podsumowanie

Co to jest klonowanie genów?

Klonowanie genów jest techniką stosowaną do lokalizowania i namnażania określonego genu z ekstrahowanego genomowego DNA organizmu poprzez budowę rekombinowanego DNA. Genomowy DNA zawiera tysiące różnych genów kodowanych dla białek. Po ekstrakcji DNA obejmuje wszystkie możliwe geny, które może znieść. Technika klonowania genów umożliwiła wykrycie określonego genu z całego DNA. Dlatego klonowanie genów służy jako ważne narzędzie w biologii molekularnej.

Stworzenie biblioteki genomowej organizmu jest niezbędne w klonowaniu genów, jeśli nie ma pojęcia o lokalizacji odpowiedniego genu w DNA. Bibliotekę genomową tworzy się, wykonując następujące kroki.

Krok 1: Ekstrakcja całkowitego DNA z organizmu zawierającego pożądany gen.

Krok 2: Ograniczenie trawienia ekstrahowanego DNA w celu wytworzenia małych, łatwych do zarządzania fragmentów. Ten etap jest ułatwiony przez endonukleazy restrykcyjne.

Krok 3: Wybór odpowiedniego wektora i otwarcie DNA wektora przy użyciu tych samych endonukleaz restrykcyjnych. Plazmidy bakteryjne są powszechnie stosowane jako wektory do przenoszenia obcego DNA. Plazmidy to małe kółka DNA znajdujące się w bakteriach.

Krok 4: Połączenie wektora DNA i rozdrobnionego DNA w celu uzyskania rekombinowanej cząsteczki DNA. Ten etap jest regulowany przez ligazę DNA.

Krok 5: Przenoszenie rekombinowanych cząsteczek DNA do bakterii gospodarza. Ten etap jest znany jako transformacja i odbywa się za pomocą szoku cieplnego.

Krok 5: Przeszukiwanie transformowanych komórek bakteryjnych na pożywce hodowlanej. Mieszaną populację transformowanych i nietransformowanych komórek gospodarza uzyskuje się na końcu procesu transformacji. Ponieważ gen będący przedmiotem zainteresowania obejmuje tylko transformowane komórki gospodarza. Dlatego konieczne jest wybranie transformowanych komórek. Wyboru dokonuje się za pomocą selektywnych pożywek zawierających antybiotyki. Tylko transformowane komórki rosną na tym podłożu przesiewowym, umożliwiając selekcję.

Krok 6: Rosnące bakterie do produkcji biblioteki genów. Na tym etapie transformowane komórki gospodarza wprowadza się do świeżej pożywki hodowlanej, która zapewnia optymalne wymagania wzrostu. Wszystkie kolonie na płytkach hodowlanych reprezentują bibliotekę genomową tego organizmu.

Krok 7: Zrekombinowaną cząsteczkę DNA zawierającą gen będący przedmiotem zainteresowania należy przeszukać z tysięcy sklonowanych fragmentów rekombinowanego DNA. Można tego dokonać za pomocą sond, które zaznaczają konkretny gen lub specyficzne wyniki białka z tego genu.

Po zidentyfikowaniu zainteresowanego genu zawierającego kolonię bakteryjną na podstawie całkowitej liczby kolonii, można wykonać miliony kopii rekombinowanego plazmidu zawierającego gen.

Klonowanie genów jest wykorzystywane do tworzenia bibliotek genów, produkcji specjalnych białek, witamin, antybiotyków, hormonów, sekwencjonowania i mapowania genomów organizmów, tworzenia wielu kopii DNA poszczególnych osób w kryminalistyce itp..

Rysunek_1: Klonowanie genów

Co to jest PCR?

Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) to technika, która generuje dużą liczbę kopii określonego fragmentu DNA. Wykładniczą amplifikację określonej sekwencji DNA uzyskuje się metodą PCR pod in vitro warunki. Ta technika jest bardzo potężnym narzędziem w biologii molekularnej, ponieważ może pomnożyć małą próbkę DNA w użyteczną ilość. PCR został wprowadzony przez Kary'ego Mullisa w 1983 roku, a ten nagradzany wynalazek spowodował ogromny postęp w dziedzinie biologii molekularnej.

Technika PCR przebiega zgodnie z powtarzanymi reakcjami PCR, jak pokazano na rycinie 02. Jedna reakcja PCR składa się z trzech głównych etapów zachodzących w trzech różnych temperaturach; denaturacja dwuniciowego DNA w 94 ⁰C, wyżarzanie starterów w 68 ⁰C i wydłużenie nici przy 72 ⁰C. Dlatego, gdy przeprowadzana jest PCR, fluktuacja temperatury powinna być wysoce utrzymywana dla prawidłowej replikacji. PCR przeprowadza się w maszynie PCR wewnątrz probówek PCR. Do probówek PCR załadowano prawidłowe mieszaniny PCR zawierające matrycowe DNA, polimerazę Taq, startery, dNTP i bufor. Denaturowanie dwuniciowego DNA próbki do jednoniciowego DNA odbywa się poprzez zerwanie wiązań wodorowych między komplementarnymi zasadami w 94–98 ⁰C. Następnie pojedyncze nici matrycy DNA są eksponowane na startery. Należy zapewnić parę podkładów (do przodu i do tyłu) i powinny one być termostabilne, aby tolerować wysokie temperatury. Startery to jednoniciowe krótkie sekwencje DNA komplementarne do końców docelowego fragmentu DNA. Syntetyczne startery stosuje się w PCR. Startery wiążą się z komplementarnymi zasadami próbki DNA i inicjują syntezę nowej nici. Ten etap jest katalizowany przez enzym zwany polimerazą Taq; termostabilny enzym polimerazy DNA wyizolowany z Thermus auqaticus. Gdy dostępne są startery i nukleotydy (bloki budulcowe), polimeraza Taq konstruuje nową nić DNA komplementarną do matrycy DNA. Pod koniec programu PCR amplifikowany fragment DNA obserwuje się za pomocą elektroforezy żelowej. Jeśli wymagana jest dalsza analiza, produkt PCR jest oczyszczany z żelu.

PCR jest bardzo przydatny do diagnozowania i monitorowania chorób genetycznych i nabytych, identyfikacji przestępców (w dziedzinie medycyny sądowej), badania struktury i funkcji docelowego segmentu DNA, sekwencjonowania i mapowania genomów organizmów itp. PCR stał się rutynowa technika laboratoryjna w laboratoriach medycznych i biologii molekularnej wśród naukowców, ponieważ ma ona różnorodne zastosowania.

Rysunek_2: Reakcja łańcuchowa polimerazy

Jaka jest różnica między klonowaniem genów a PCR?

Klonowanie genów vs PCR
Klonowanie genów to proces tworzenia wielu kopii konkretnego genu in vivo poprzez rekombinowany DNA i transformację do bakterii gospodarza.	Technika PCR daje wiele kopii określonej sekwencji DNA in vitro poprzez powtarzane cykle reakcji PCR.
Wymóg konstruowania rekombinowanego DNA
Rekombinowany DNA jest wytwarzany w celu zlokalizowania genu.	Rekombinowany DNA nie jest wytwarzany.
Potrzeba pracy
Ten proces jest pracochłonny.	Intensywna praca nie jest potrzebna.
Proces in vivo lub in vitro
Konstrukcja rekombinowanego DNA jest in vitro a amplifikacja DNA jest in vivo.	Amplifikacja DNA zachodzi całkowicie in vitro.

Podsumowanie - klonowanie genów vs PCR

Klonowanie genów i PCR to dwie metody stosowane do amplifikacji DNA. PCR to in vitro proces, który tworzy wiele kopii DNA określonego fragmentu DNA bez użycia rekombinowanego DNA i organizmu gospodarza. Klonowanie genów jest przede wszystkim in vivo proces, w wyniku którego powstaje wiele kopii zainteresowanego genu w organizmie gospodarza poprzez budowę rekombinowanego DNA. Jest to różnica między klonowaniem genów a PCR.

Odniesienie:
1. Griffiths, Anthony JF. „Klonowanie określonego genu”. Współczesna analiza genetyczna. U.S. National Library of Medicine, 1 stycznia 1999. Web. 22 lutego 2017 r
2. „Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR).” Narodowe Centrum Informacji Biotechnologicznej. U.S. National Library of Medicine, n.d. Sieć. 22 lutego 2017 r

Zdjęcie dzięki uprzejmości:
1. „Rysunek 17 01 06” CNX OpenStax - (CC BY 4.0) przez Commons Wikimedia
2. „PCR” Autor: Madprime - Praca własna (CC BY-SA 3.0) przez Commons Wikimedia