Różnica między klonowaniem a subklonowaniem

Kluczowa różnica - klonowanie vs. subklonowanie
 

Klonowanie i subklonowanie to molekularne procedury biologiczne, które tworzą genetycznie identyczne komórki lub organizmy zawierające DNA lub gen, które są przedmiotem zainteresowania. Klonowanie to technika polegająca na wstawieniu zainteresowanego genu lub DNA do wektora, replikacji go w bakterii gospodarza oraz produkcji komórek lub organizmów, które są dokładnymi kopiami struktury genetycznej. Subklonowanie jest techniką polegającą na wstawieniu interesującego genu, który jest już wstawiony do wektora, do wektora wtórnego, replikacji go w bakterii gospodarza i wytworzeniu genetycznie identycznych kopii komórek lub organizmów. Kluczowa różnica między klonowaniem a subklonowaniem polega na tym, w klonowaniu gen będący przedmiotem zainteresowania, po ligacji z wektorem, kontynuuje proces klonowania, podczas gdy w subklonowaniu już sklonowany gen będący przedmiotem zainteresowania jest oddzielany od wektora macierzystego i wstawiany ponownie do wektora biorcy i kontynuuje proces.

ZAWARTOŚĆ
1. Przegląd i kluczowa różnica
2. Co to jest klonowanie
3. Co to jest subklonowanie
4. Porównanie obok siebie - Klonowanie a subklonowanie
5. Podsumowanie

Co to jest klonowanie?

Klonowanie to procedura, która produkuje genetycznie identyczne organizmy lub komórki. W naturze klonowanie odbywa się w ramach bezpłciowego rozmnażania. Gdy nie ma rekombinacji ani modyfikacji genetycznej, komórki potomne otrzymują ten sam skład genetyczny rodzica. Organizmy prokariotyczne i eukariotyczne tworzą klony poprzez rozszczepienie binarne, pączkowanie, mitozę itp. W biologii molekularnej klonowanie genów lub określonych fragmentów DNA jest popularną metodą badania struktury i funkcji tej konkretnej sekcji DNA.

Głównym celem klonowania molekularnego jest wykonanie milionów kopii genetycznie identycznych komórek lub organizmów zawierających interesujący fragment DNA (głównie geny). Tworzy organizmy z dokładnymi genetycznymi kopiami innego. Po pierwsze, konkretne geny klonuje się w badaniach molekularnych w celu uzyskania informacji strukturalnych i funkcjonalnych oraz do sekwencjonowania DNA. Również do produkcji określonych białek lub produktów na dużą skalę szeroko stosuje się klonowanie.

Procedura klonowania

Podstawowe etapy procedury klonowania są następujące.

1. Identyfikacja i izolacja genu będącego przedmiotem zainteresowania. (Amplifikacja genu będącego przedmiotem zainteresowania za pomocą PCR).
2. Trawienie restrykcyjne genu będącego przedmiotem zainteresowania (endonukleaza restrykcyjna przecina gen).
3. Trawienie restrykcyjne DNA wektora. (DNA wektorowe wycina się również przy użyciu tej samej endonukleazy restrykcyjnej).
4. Wstawienie genu do wektora i utworzenie rekombinowanej cząsteczki.
5. Transformacja rekombinowanego wektora w bakterię gospodarza.
6. Izolacja i identyfikacja transformowanych bakterii (wektor plazmidowy powinien zawierać gen selekcyjny, najczęściej gen oporności na antybiotyk do przeszukiwania transformowanych bakterii).
7. Ekspresja genu rekombinowanego w gospodarzu.

Rysunek_01: Procedura klonowania

Co to jest subklonowanie?

Subklonowanie to procedura przenoszenia genu będącego przedmiotem zainteresowania z jednego wektora na inny wektor, aby zobaczyć ekspresję genu w celu uzyskania pożądanej funkcjonalności genu. W tej metodzie zaangażowane są dwa wektory; mianowicie wektor macierzysty i wektor docelowy. Sklonowane wstawki są ponownie przenoszone do drugiego wektora podczas subklonowania. Celem przeniesienia genu z pierwszego wektora do drugiego wektora jest uzyskanie czegoś, czego nie mógłby zrobić pierwszy wektor lub ponowne oddzielenie genu w już sklonowanym fragmencie DNA i ekspresja go sama. Na początku w tej procedurze stosuje się enzymy restrykcyjne.

Procedura subklonowania

Podstawowe kroki subklonowania są następujące.

1. Za pomocą endonukleaz restrykcyjnych oddzielenie DNA będącego przedmiotem zainteresowania w plazmidzie dawcy (wektorze macierzystym).
2. Amplifikacja DNA będącego przedmiotem zainteresowania za pomocą PCR.
3. Oczyszczanie produktu PCR (DNA będący przedmiotem zainteresowania) za pomocą elektroforezy żelowej.
4. Otwarcie plazmidu biorcy przez te same endonukleazy restrykcyjne, które zastosowano do oddzielenia DNA będącego przedmiotem zainteresowania w plazmidzie macierzystym.
5. Ligacja DNA będącego przedmiotem zainteresowania (genu) do plazmidu biorcy w celu utworzenia subklonowanego plazmidu.
6. Transformacja subklonowanego wektora do kompetentnej bakterii gospodarza.
7. Przesiewanie transformowanych komórek.
8. Oczyszczanie plazmidowego DNA i zastosowanie do sekwencjonowania DNA lub ekspresji genów w celu uzyskania pożądanych produktów.

Subklonowanie przeprowadza się przy okazji izolacji jednego genu ze sklonowanej grupy genów lub gdy gen będący przedmiotem zainteresowania musi zostać przeniesiony do użytecznego plazmidu, aby zobaczyć dokładną funkcję genu będącego przedmiotem zainteresowania.

Rysunek_02: Procedura subklonowania

Jaka jest różnica między klonowaniem a subklonowaniem?

Klonowanie a subklonowanie
Klonowanie to procedura, która produkuje genetycznie identyczne organizmy lub komórki.	Subklonowanie to procedura przenoszenia interesującego genu z jednego wektora na inny wektor, aby zobaczyć ekspresję genu w celu uzyskania pożądanej funkcjonalności genu.
Proces
Oddziel DNA będący przedmiotem zainteresowania od organizmu, raz wstaw do wektora i sklonuj	Już sklonowane DNA jest oddzielane od pierwszego wektora i wstawiane do drugiego wektora i klonowane.
Wstaw ruch za pomocą wektorów
Nie przenosi wstawek (DNA będące przedmiotem zainteresowania) z jednego wektora na inny wektor.	Przenieś wstawki z wektora macierzystego do wektora docelowego.

Podsumowanie - klonowanie a subklonowanie

Klonowanie tworzy genetycznie identyczne komórki lub organizmy z wprowadzonym genem lub DNA będącym przedmiotem zainteresowania. Przebiega przez rozdział i wstawienie DNA będącego przedmiotem zainteresowania do wektora i ekspresję w bakterii gospodarza. Klonowanie dzieli podobne kroki z klonowaniem. Jednak w subklonowaniu już sklonowany fragment DNA (gen będący przedmiotem zainteresowania) jest wstawiany do wektora i transformowany do bakterii gospodarza. Jest to kluczowa różnica między klonowaniem a subklonowaniem.

Bibliografia

1. Lodish, Harvey. „Klonowanie DNA za pomocą wektorów plazmidowych”. Biologia komórek molekularnych. 4. edycja U.S. National Library of Medicine, 01 stycznia 1970. Web. 05 marca 2017 r
2. „Subklonowanie”. Wikipedia. Fundacja Wikimedia, 14 lutego 2017 r. Internet. 06 marca 2017
3. „Subklonowanie”. Subklonowanie | Artykuły o otwartym dostępie | Czasopisma z otwartym dostępem | Materiały konferencyjne | Redakcja | Autorzy | Recenzenci | wydarzenia naukowe. N.p., n.d. Sieć. 06 marca 2017
4. Wackerhage, Henning. „Jak subklonować”. Jak subklonować. N.p., 01 stycznia 1970. Web. 06 marca 2017

Zdjęcie dzięki uprzejmości

1. Procedura klonowania molekularnego - CNX OpenStax [CC BY 4.0], za pośrednictwem Wikimedia Commons
2. Procedura subklonowania - autor: Pierwszym przesyłającym był Takometer z angielskiej Wikipedii (przeniesiony z en.wikipedia do Commons.) [CC BY 2.5], za pośrednictwem Wikimedia Commons